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08/12/2010
Cellules souches et perspectives thérapeutiques
Jean-Yves Le Gall et Raymond Ardaillou
Jean-Yves Le Gall et Raymond Ardaillou
Résumé
Il existe différents types de cellules souches (CS) caractérisées par leurs propriétés fonctionnelles : CS embryonnaires totipotentes ( jusqu’au stade 8 blastomères -72 heures après la fécondation) capables d’induire la totalité du développement embryonnaire et fœtal ; CS embryonnaires pluripotentes isolées du blastocyste (5 jours), capables de se différencier en donnant les trois feuillets (ectoderme, endoderme, mésoderme) caractéristiques de la gastrulation et conduisant in vitro à des lignées immortelles ; à partir du 46ième jour CS fœtales, puis adultes spécialisées, dites multipotentes assurant le développement, puis le renouvellement des tissus, mais avec une efficacité diminuant avec l’âge (un cas particulier est celui des CS mésenchymateuses dont les propriétés sont voisines de la pluripotence) ; enfin, CS pluripotentes induites (iPS pour « induced pluripotent stem cells ») résultant de l’acquisition d’un nouvel état suivi de reprogrammation in vitro d’une cellule adulte sous l’effet d’un apport exogène de différents facteurs de transcription. L’ensemble des conditions du maintien en culture sans instabilité génétique des CS pluripotentes ou de leur différenciation en phénotypes cellulaires précis demande encore à être amélioré. En France, l’étude ou l’utilisation des CS embryonnaires pluripotentes ne peut se faire que dans un cadre réglementaire dérogatoire aux lois de bioéthique de 2004 établi pour 5 ans et relevant de l’Agence de la biomédecine.
L’intérêt des CS en thérapeutique repose sur l’espoir d’une médecine régénératrice. Malgré différents succès expérimentaux très prometteurs, les applications médicales sont encore aujourd’hui limitées : traitement des brûlures graves (greffon obtenu par culture de CS épidermiques), production de globules rouges fonctionnels à partir de CS CD34+ isolées de la moelle osseuse. Des développements importants sont attendus pour le traitement du diabète, des affections neurologiques (en particulier la maladie de Huntington), de l’infarctus du myocarde, de l’insuffisance cardiaque. Enfin en cancérologie, le rôle déterminant de la transformation maligne de CS devrait conduire à la mise au point de nouvelles stratégies pharmacologiques. Ces résultats soulignent l’intérêt thérapeutique prospectif des CS et la nécessité d’investissements dans ce domaine. La législation doit également évoluer comme le recommande l’Académie.
L’Académie a abordé récemment le sujet des cellules souches dans le cadre des remarques qu’elle a formulées à propos des recommandations accompagnant le rapport de la mission parlementaire sur la prochaine révision des lois de bioéthique (1). Le document ci-dessous résultant du travail de la commission I (biologie) apporte un élément d’information supplémentaire sur un thème en pleine évolution scientifique et dont les applications médicales espérées restent encore largement prospectives. Les résultats obtenus à ce jour soulignent cependant l’immense intérêt de cette voie de recherche et incitent à renouveler notre demande d’assurer aux chercheurs travaillant en France la liberté nécessaire à leurs recherches, en particulier sur les cellules souches embryonnaires humaines.
I. DIFFERENTS TYPES DE CELLULES SOUCHES
Après la fécondation, l’œuf ou zygote se divise en 2, puis 4 et 8 cellules ou blastomères identiques (72 heures). Les blastomères se polarisent ensuite en augmentant leurs contacts avec les cellules voisines et en aplatissant leurs surfaces externes : c’est la phase de compaction qui donne à l’embryon une forme de petite mûre ou morula (phase 16-32 cellules, 96 heures après la fécondation). Au stade 16 cellules l’embryon est formé de deux types cellulaires polarisés: externe et interne; au stade 32 les cellules externes commencent à acquérir leur identité d’appartenance à la lignée trophoblastique. Une cavité se forme ensuite progressivement à l’intérieur de l’embryon qui, au stade de blastocyste, (120 heures ou 5 jours), est ainsi formé d’une couche externe trophoblastique entourant la cavité et d’une masse cellulaire interne (MCI) ; celle-ci donnera naissance à deux feuillets distincts : une masse de cellules formant l’épiblaste (Epi) recouverte par un épithélium d’endoderme primitif (Epr). Au moment de l’implantation utérine (entre 6 et 12 jours chez l’Homme, 4,5 jours chez la Souris) l’embryon est formé de trois tissus: le tissu trophoblastique (Tr) qui participera ultérieurement à la formation du placenta, l’Epr qui donnera naissance en partie au sac vitellin, et l’Epi qui contribuera aux annexes embryonnaires et sera à l’origine de toutes les cellules de l’embryon lui-même, y compris ses cellules germinales.
Tout au long du développement embryonnaire puis fœtal, et enfin chez l’adulte, une série de cellules souches (CS) aux potentialités différentes peuvent être isolées et caractérisées :
. CS totipotentes jusqu’au stade 8 blastomères, capables d’induire la totalité du développement embryonnaire et fœtal
. CS pluripotentes isolées de la morula au stade 16-32 cellules.
. CS pluripotentes isolées du blastocyste.
Aux trois tissus embryonnaires présents lors de l’implantation (Tr, Epi et Epr) correspondent trois modèles in vitro de cellules souches dont le plus étudié est celui des cellules épiblastiques précoces et tardives, ces dernières capables de se différencier en donnant les trois feuillets embryonnaires (ectoderme, endoderme et mésoderme) caractéristiques de la gastrulation.
Après le 46ème jour de développement chez le fœtus, puis chez l’adulte, les différents tissus contiennent des CS spécialisées dites multipotentes assurant le développement, puis le renouvellement des tissus, mais avec une efficacité diminuant avec l’âge. Les propriétés des CS fœtales et adultes ne sont pas fondamentalement différentes. Chez le fœtus certaines d’entre elles, largement minoritaires, sont circulantes et peuvent être isolées du sang de cordon. Enfin, un cas particulier est celui des cellules souches mésenchymateuses isolées de la moelle osseuse, du tissu adipeux, du sang de cordon ou du cordon lui-même et dont les propriétés semblent voisines de la pluripotence. Le cas des cellules germinales de l’adulte est particulier. Unipotentes, elles ne deviennent totipotentes que par la fécondation.
. Pour compléter cette liste il est maintenant nécessaire d’y rajouter les cellules souches pluripotentes induites (iPS ou « Induced Pluripotent Stem cells ») résultant de l’acquisition d’un nouvel état suivie de la reprogrammation in vitro d’une cellule adulte après transfert dans cette cellule de différents facteurs de transcription.
En l’absence de marqueurs moléculaires spécifiques actuellement caractérisés, la définition d’une CS est essentiellement fonctionnelle et repose sur sa capacité à donner naissance à l’embryon ou au tissu d’intérêt. Dans le cas des CS embryonnaires, deux propriétés majeures sont retenues : l’autorenouvellement et la pluripotence. Ces deux propriétés impliquent que la division cellulaire soit à l’origine ou d’une cellule semblable à la cellule mère (autorenouvellement) ou d’un progéniteur qui va se différencier en cellules spécialisées selon le milieu (pluripotence).
L’immortalité par auto-renouvellement illimité des CS embryonnaires (et des iPS ) offre la possibilité théorique de sources inépuisables de cellules animales ou humaines ; cependant les conditions biologiques et techniques de leur entretien et de leur différenciation ne sont pas encore entièrement maitrisées : les lignées dérivées d’embryons normaux présentent une instabilité génétique au cours des repiquages successifs, avec apparition de diverses anomalies chromosomiques (en particulier une duplication en 20q 11-21), ce qui impose une vérification régulière de leur statut génétique ; la culture de CS embryonnaires nécessite la présence d’un substratum de cellules nourricières (fibroblastes…) et de différentes cytokines dont le bFGF (« basic Fibroblast Growth Factor ») pour maintenir leurs capacités d’auto-renouvellement et de pluripotence. Les produits d’origine animale utilisés habituellement dans ces cultures (fibroblastes embryonnaires de souris, sérum de veau fœtal …..) dont les risques potentiels (réactions immunologiques, transmission d’agents pathogènes…) sont un frein aux applications cliniques, tendent aujourd’hui à être remplacés par des produits humains.
Pour résoudre des problèmes quantitatifs de production, de nouveaux procédés de culture en suspension (et non plus sur milieux solides) sont à l’étude….La culture de CS embryonnaires demande donc l’établissement et le respect de protocoles entièrement et rigoureusement standardisés. Enfin la mise en pratique médicale d’applications thérapeutiques nécessite que ces protocoles puissent passer des laboratoires de recherche à l’industrie pharmaceutique en vue d’une production standardisée et abondante, ce qui demande des mises au point et des investissements spécifiques.
La pluripotence des CS se définit chez la souris par leur capacité, lorsqu’elles sont injectées dans un blastocyste, à développer un embryon chimérique. Si préalablement à l’injection de CS embryonnaires, une électrofusion provoque la transformation d’un blastomère à deux cellules en blastomère tétraploïde conduisant ainsi à la formation des annexes extra-embryonnaires, l’embryon obtenu dérive entièrement des CS (la même démonstration a été faite avec les iPS). Pour des raisons techniques et surtout éthiques les mêmes démonstrations sont impossibles avec des lignées de CS embryonnaires humaines et le critère de pluripotence retenu est leur capacité d’induire la formation de tératomes (formés de façon anarchique par les dérivés des trois tissus embryonnaires) lorsqu’elles sont injectées à des souris immunodéficientes. Au plan biologique, la pluripotence est donc la capacité des CS embryonnaires (et des iPS) à se différencier en n’importe quel phénotype cellulaire ; cet état de pluripotence dépend de l’expression de différents facteurs de transcription (OCT4, SOX2, NANOG, SALL4….), d’une conformation de la chromatine, « ouverte » et non « fermée » comme chez l’adulte, et permettant ainsi l’expression des gènes de la pluripotence, de facteurs épigénétiques (modifications biochimiques telles que l’acétylation ou la méthylation des histones, la méthylation des ADN….), mais l’ensemble de ces conditions biologiques est encore loin d’avoir été identifié. La suppression du bFGF du milieu de culture induit un programme de différenciation dont la finalité dépend de la nature des cytokines et facteurs de croissance apportés, et dont le bon déroulement nécessite le respect parfait de toutes les étapes du développement ontologique normal, ce qui explique sans doute les difficultés expérimentales à obtenir des cellules totalement différenciées en type adulte. En outre, si les protocoles utilisés aujourd’hui permettent d’obtenir une vingtaine de phénotypes cellulaires précis, il ne s’agit dans la plupart des cas que d’un enrichissement et non de l’obtention d’une population homogène, ce qui demande une phase supplémentaire de tri cellulaire qui reste de faible rendement. L’ensemble des facteurs nécessaires pour guider la différenciation d’une CS pluripotente vers un phénotype particulier parmi des centaines de possibilités est encore loin d’être connu ; leur identification et la mise au point de protocoles rigoureusement standardisés sont donc à ce jour nécessaires.
Rappelons que si en 2009 il y avait dans le monde environ 500 lignées de CS embryonnaires normales et une vingtaine porteuses d’une anomalie génétique, dont 4 avec des anomalies chromosomiques, dans notre pays les demandes d’importation ou de création de ces lignées ne peuvent se faire que dans un cadre réglementaire dérogatoire aux lois de bioéthique de 2004 établi pour 5 ans. Ce système d’abord géré par les ministères relève maintenant de la compétence de l’Agence de la biomédecine qui délivre les autorisations nécessaires pour effectuer des recherches sur embryons ou cellules souches embryonnaires humaines, les conserver, les importer ou les exporter, et cela au vu de programmes répondant à un certain nombre de conditions et de critères, en particulier la perspective de progrès thérapeutiques notables et l’absence de méthodes alternatives. L’Agence contrôle la mise en œuvre de ces programmes et assure leur suivi. A ce jour, elle a délivré 50 autorisations contre 8 refus ; six projets ont été autorisés à dériver de nouvelles lignées, 25 de ces lignées ont été déclarées à l’Agence, dont une seule normale (à comparer avec le fait que plus de 150 000 embryons surnuméraires provenant de fécondations in vitro sont actuellement conservés dont 10 000 ayant fait l’objet d’un don pour la recherche), les autres étant issus d’un diagnostic préimplantatoire (DPI) et constituant des modèles pour l’étude d’anomalies génétiques ou chromosomiques. Les embryons sont développés jusqu’au stade de blastocyste : après élimination de la zone pellucide (par la pronase ou par laser) la masse cellulaire interne est isolée et mise en culture. La grande majorité des projets en cours utilise donc des lignées de CS embryonnaires importées de l’étranger avec différentes finalités : biologie de l’embryon (études des mécanismes de ségrégation chromosomique, d’apoptose, d’inactivation du chromosome X, de méthylation de l’ADN…), thérapie cellulaire, stratégie de criblage de molécules, modèles d’étude de maladies. Les pathologies étudiées affectent des tissus dérivés des trois feuillets embryonnaires : ectoderme (maladie de Huntington, maladie d’Alhzeimer, ataxie spinocérébelleuse, génodermatoses…), mésoderme (hémopathies malignes, SIDA, myopathies…) et endoderme (mucoviscidose, maladies hépatiques…).
Les CS embryonnaires sont les seules pluripotentes, les CS fœtales ont un potentiel restreint de différenciation, néanmoins supérieur à celui des CS adultes ; celles-ci sont spécialisées par tissu, ne peuvent donner naissance à des lignées immortelles et sont sujettes au processus de sénescence (dont elles sont peut-être des acteurs déterminants). Dans un tissu, elles sont habituellement rares ; elles sont fragiles, d’un faible pouvoir d’amplification et localisées au fond d’une niche constituée de cellules stromales sécrétant différents facteurs qui les maintiennent dans un état indifférencié et d’une matrice extracellulaire. Ces CS adultes sont classées en trois groupes :
1) CS spécialisées appartenant à des tissus à taux de renouvellement élevé (épiderme, muqueuse intestinale, tissu hématopoiëtique…) et relativement faciles à identifier ;
2) CS spécialisées présentes dans des tissus à faible potentiel de renouvellement (poumon, rein, tissu nerveux…) et dont le comportement in vitro est souvent aberrant ( exemple des CS neurales formant des « neurosphères ») ;
3) CS généralistes désignées sous le terme de cellules souches mésenchymateuses , présentes principalement dans le sang du cordon, le cordon lui-même, le placenta et la moelle osseuse, et dont les capacités de différenciation sont étendues (tissus mésodermiques, mais aussi potentiellement, ectodermiques et endodermiques) (cf BANM 2010 194 141-152).
Une autre voie est également étudiée, celle de la création non physiologique de CS pluripotentes. Un premier exemple est celui du transfert dans un ovocyte énucléé du noyau d’une cellule somatique (ex : fibroblaste) qui se reprogramme et se réorganise comme le noyau d’une cellule embryonnaire, cette nouvelle CS conduisant ensuite au développement d’un embryon si le blastocyste ainsi créé est réintroduit dans un utérus gravide. Le premier exemple a été celui de la brebis Dolly. Sinon, on peut aussi dériver des cellules souches embryonnaires à partir de la masse interne, et dans ce cas, il ne s’agit plus d’un clonage reproductif. Une deuxième possibilité est la reprogrammation de noyaux somatiques en noyaux pluripotents par fusion avec une CS pluripotente (ex : lymphocyte B humain et CS embryonnaire murine conduisant à une cellule tétraploïde. Mais l’avancée majeure a été apportée en 2006 par les travaux de Takahashi et Yamanaka (2) qui ont démontré la possibilité de réaliser directement la reprogrammation de cellules somatiques en CS pluripotentes, à savoir les cellules souches pluripotentes induites (« induced pluripotent stem cells » ou iPS). A partir de fibroblastes de souris et, plus récemment, de fibroblastes humains, les iPS ont été obtenues en une trentaine de jours sous l’effet d’un apport exogène de facteurs de transcription (au minimum 4 dont obligatoirement OCT4 et SOX2) recombinés dans un vecteur rétroviral ou lentiviral. Cet apport exogène n’est en fait nécessaire que pendant une dizaine de jours, une surexpression endogène de ces facteurs étant ensuite suffisante pour assurer le relais. En raison des risques de transformation maligne, l’utilisation des vecteurs rétroviraux tend à être remplacée par celle d’adénovirus qui s’éliminent spontanément en une dizaine de jours ou encore mieux par l’apport direct des protéines recombinantes synthétisées in vitro. Au cours de cette reprogrammation, on observe une extinction progressive des gènes caractéristiques du fibroblaste, une réexpression de gènes embryonnaires (en particulier SSEA1 et 4), une activation de la télomérase, et, éventuellement, la réactivation d’un chromosome X sexuel. Pour des raisons encore mal comprises l’efficacité de cette technique est très faible : en moyenne 10 iPS humaines à partir de 50 000 fibroblastes du derme ; elle est améliorée par des agents de déméthylation comme l’acide valproïque, elle est meilleure à partir d’un fibroblaste fœtal qu’à partir d’un fibroblaste adulte. Les critères de pluripotence des iPS sont a priori les mêmes que ceux des CS : auto-renouvellement illimité en présence de bFGF, formation de corps embryoïdes in vitro et de tératomes après injection chez la souris, obtention de souris chimériques après injection dans un blastocyste ; néanmoins, les capacités de différenciation en un tissu donné ne sont ni constantes ni identiques d’une lignée à l’autre, et cela pour des raisons encore inconnues. Les iPS exposent également à un risque important de transformation maligne due à la présence de l’oncogène c-myc utilisé pour la reprogrammation (développement d’un carcinome dans 30 % des cas). L’intérêt porté à ce type de lignée cellulaire est dû au fait qu’elle présente potentiellement plusieurs avantages importants : origine non embryonnaire, possibilité d’établir une lignée spécifique d’un sujet ou d’un patient et donc absence de réaction immunitaire en cas d’utilisation thérapeutique. On a également parlé de l’absence de problèmes éthiques, religieux ou légaux, ce qui est inexact à différents égards. En effet, il y a nécessité de l’information et du consentement des personnes qui donnent leurs cellules pour obtenir des iPS, sachant que ces cellules peuvent ensuite être soumises à un séquençage génétique à large échelle, rendant caduque l’anonymisation des données. En outre, via la fusion avec un embryon tétraploïde, un clonage reproductif est théoriquement possible. Enfin, le problème de la reprogrammation en cellules germinales risque de se poser. Les iPS sont aujourd’hui un remarquable outil d’étude des mécanismes de la différenciation cellulaire, de modélisation de tout type de maladies génétiques, de criblage de molécules pharmacologiques….Néanmoins les anomalies observées (instabilité génétique, risque de transformation maligne, variabilité de différenciation…) demandent à être maitrisées avant de progresser vers leur utilisation en thérapie. Trois publications récentes apportent des résultats prometteurs. L’une, signée par le père de la technique S Yamanaka (3) montre qu’il est possible, chez la Souris, de reprogrammer des iPS en cellules hépatiques fonctionnelles capables de régénérer un foie amputé aux deux tiers ou un foie gravement atteint par déficit génétique en fumarylacétoacétate hydrolase. Les deux autres font conclure qu’il est possible d’obtenir des modèles cellulaires de maladies génétiques facilitant leur étude in vitro. D’une part, des cellules du foie ont été dérivées de cellules cutanées de patients atteints de maladies génétiques à expression hépatique en conservant les mêmes caractéristiques que les cellules du foie du donneur (4) ; d’autre part, des fibroblastes cutanées de patients atteints de la maladie du QT long ont été reprogrammées en cardiomyocytes porteurs de la mutation (5). On obtient ainsi dans les deux cas de précieux modèles d’étude.
II. INTERET PROSPECTIF EN THERAPEUTIQUE
Bien que les cellules souches suscitent de nombreux intérêts en biologie fondamentale ou en pharmacologie, notre propos se limitera aux perspectives thérapeutiques. Elles découlent de l’espoir d’une médecine régénératrice et concernent la plupart des spécialités médicales. Nous donnons ci-dessous quelques résultats à titre d’exemples.
A. DERMATOLOGIE
Rappelons que chez les mammifères, le renouvellement après desquamation des cellules de la surface externe de la peau est assuré par les kératinocytes de la couche basale qui se divisent activement et se différencient en cellules de la couche cornée. Cette activité implique l’existence de cellules souches : l’épiderme interfolliculaire et les follicules pileux possèdent leurs propres CS spécialisées. Contrairement aux CS des follicules pileux confinés dans une niche appelée « bulge », les CS de l’épiderme sont disséminées le long de la membrane basale.
Le traitement des brûlures étendues implique d’une part l’excision des tissus nécrosés et lorsque les surfaces atteintes sont très étendues leur protection temporaire par des peaux allogéniques conservées au congélateur, et d’autre part, secondairement, une greffe autologue d’épiderme. Le greffon est préparé en 3 à 4 semaines par culture in vitro de CS épidermiques (ou progéniteurs de kératinocytes) isolées d’un fragment de peau intacte. Ce traitement sauve la vie de grands brûlés, mais au prix de lourdes séquelles (cicatrices, brides…) dues pour l’essentiel à l’absence de régénération du derme et/ou aux mauvaises qualités des jonctions dermo-épidermiques. Une amélioration de la qualité du greffon est obtenue par culture des kératinocytes sur une matrice de fibrine incluant des CS mésenchymateuses dont sont mises à profit les propriétés stimulatrices de la prolifération de ces cellules, ainsi que les propriétés immuno-modulatrices, antiseptiques, anti-inflammatoires et paracrines. Dans ces conditions sont obtenus des feuillets formés de trois ou quatre assises de kératinocytes entièrement cohésives et jointives contrairement au procédé classique, et reposant sur une couche de cellules épithéliales.
Les lésions provoquées par les sources radioactives sont non seulement superficielles mais aussi profondes, très douloureuses, inflammatoires et extensives, nécessitant des amputations tissulaires importantes et souvent répétées. Chez ces patients (rares), l’effet bénéfique des cellules mésenchymateuses autologues (obtenues par ponction de moelle osseuse puis culture dans un milieu enrichi en facteurs de croissance apportés par un lysat de plaquettes sanguines) semble démontré.
Des perspectives intéressantes sont apportées par des travaux expérimentaux récents (6) montrant la capacité des cellules souches de thymus de rat prélevées après la naissance à se transformer sans manipulation génétique en cellules de la peau lorsqu’elles sont cultivées dans le microenvironnement physiologique de ces cellules. Les cellules cutanées, ainsi obtenues, produisent chez le Rat après transplantation une peau normale avec ses différents éléments dont l’épiderme, les follicules pileux et les glandes sébacées, ce qui constitue un progrès important par rapport à la simple reconstitution de l’épiderme.
B. HEMATOLOGIE
La production in vitro de globules rouges (GR) est susceptible de présenter un grand intérêt pratique car, en raison du vieillissement de la population, les besoins de transfusion sanguine risquent de ne plus être couverts par les seuls dons. Depuis plus d’un demi-siècle, les recherches de produits de substitution remplissant les fonctions de transporteur d’oxygène se sont avérées infructueuses, à l’exception toutefois de l’utilisation du perfluorocarbone dans certaines circonstances opératoires. Depuis quelques années la synthèse de GR est possible in vitro à partir de cellules souches CD34+ isolées de la moelle osseuse, du sang circulant ou du sang de cordon ; le protocole comporte trois phases : 1) prolifération et induction de la différenciation érythroïde en présence de facteurs de croissance, d’interleukine 3 et d’érythropoïetine , 2) culture sur un modèle reconstituant le microenvironnement physiologique avec en particulier des cellules mésenchymateuses et en présence d’érythropoïetine seule, 3) culture en présence des seules cellules stromales et en l’absence de tout facteur de croissance. Au cours de ce protocole de 18 à 20 jours les cellules parcourent les différents stades de la différenciation : proérythroblaste, érythroblaste basophile, acidophile, réticulocyte et globule rouge énucléé (environ 95%). Cette différenciation n’est cependant pas totale au plan métabolique car la majorité du contenu globulaire est constitué d’hémoglobines adultes et fœtales ; ces hémoglobines sont parfaitement fonctionnelles et le contenu enzymatique (glucose 6 phosphate déshydrogénase, pyruvate kinase….) est normal témoignant de sa capacité à maintenir un taux d’ATP suffisant pour éviter l’accumulation du 2-3 diphosphoglycérate qui entraînerait elle-même une diminution d’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène. La production expérimentale en laboratoire de ces GR est bien entendu quantitativement limitée et le développement industriel de ce protocole nécessiterait la mise au point de bioréacteurs adaptés.
La solution idéale pour satisfaire tous les besoins de la transfusion sanguine serait de disposer d’une source permanente et illimitée de produits sanguins. Une première possibilité est l’utilisation de CS embryonnaires dont la différenciation se fait en deux grandes étapes : d’abord en cellules souches CD34+, puis en cellules érythroïdes ; les protocoles actuels n’obtiennent qu’une différenciation incomplète puisque 30 à 60% des globules sont encore nucléés et contiennent des hémoglobines embryonnaires et fœtales. Une deuxième possibilité est d’utiliser les CS pluripotentes induites ou iPS : le protocole de différenciation est semblable au précédent mais la proportion de cellules énucléées est encore plus faible (environ 10%). Trois lignées d’iPS et deux lignées de CS embryonnaires sont actuellement utilisées expérimentalement ; au-delà des difficultés à maitriser une différenciation complète, un problème majeur à résoudre est celui de l’insuffisance des rendements : une CS conduisant à environ 500 GR et une iPS à environ 350.
Outre la satisfaction quantitative des besoins transfusionnels ou qualitative, par exemple chez des patients allo-immunisés ou présentant des groupes rares, différentes applications thérapeutiques peuvent également être espérées des iPS comme le traitement de la drépanocytose par substitution de l’Hb A ou F normales à l’Hb S tel que cela vient d’être expérimentalement réalisé chez des souris humanisées drépanocytaires. A côté de la production de globules rouges, on peut penser pouvoir aussi obtenir des cellules hématopoïétiques pour les greffes autologues dans le traitement des différentes hémopathies malignes comme les aplasies médullaires ou les leucémies aiguës.
C. PANCREAS et DIABETE :
Le diabète étant défini simplement sur le plan physiopathologique comme une incapacité de la masse des cellules β à réguler la glycémie (destruction de ces cellules dans le cas du type I, insuffisance fonctionnelle dans le type II), la greffe cellulaire apparait logiquement comme une alternative aux traitements médicamenteux et dès 2000 les premières tentatives de thérapie cellulaire par greffe d’îlots de Langerhans ont été publiées. Les sources alternatives de cellules β sont potentiellement de deux types : non physiologiques (xénogreffe ou transdifférenciation à partir d’autres tissus tels que le foie, la moelle osseuse, le tube digestif…) ou physiologiques (différenciation à partir de CS embryonnaires, d’iPS, de CS du pancréas fœtal ou adulte). La différenciation en cellules β synthétisant de l’insuline à partir de CS embryonnaires implique de reproduire in vitro l’ensemble des étapes de l’embryogenèse ; ce processus n’est pas encore complètement maitrisé, en particulier dans ses dernières phases : s’il est en effet possible d’obtenir de l’endoderme, puis des progéniteurs pancréatiques, il ne l’est pas encore pour les cellules β adultes. Etant donné l’énorme intérêt potentiel médical mais aussi financier de cette thérapie cellulaire, de nombreuses structures (laboratoires académiques, firmes de biotechnologie et laboratoires pharmaceutiques) s’intéressent à cette question. Une autre possibilité est de partir de CS pancréatiques (thérapie régénératrice) : l’existence de tels progéniteurs a été prouvée chez la souris ; il reste à faire la même démonstration chez l’homme, à caractériser les facteurs biologiques contrôlant la transformation de ces progéniteurs en cellules β et à trouver éventuellement des molécules susceptibles de déclencher le processus. De nombreux laboratoires investissent également dans le développement de cette thérapie régénératrice.
D. SYTEME NERVEUX
La notion classique d’un non renouvellement des cellules neurales adultes est aujourd’hui remise en cause, mais les applications thérapeutiques restent théoriques. Chez le rongeur adulte des CS sont présentes dans la zone sous-ventriculaire du cerveau et leur principale activité est d’assurer le renouvellement des cellules du bulbe olfactif : environ 30 000 cellules y sont produites chaque jour, soit à peu près 1% de l’effectif cellulaire total ; elles ont une durée de vie de quelques semaines et, en cas de stimulation olfactive, la synthèse peut atteindre 60 000 neurones par jour. Les cellules souches de la zone sous-ventriculaire sont des astrocytes exprimant entre autres la GFAP (« Glial Fibrillar Acidic Protein »). Il a été démontré que ces CS ne constituaient pas une population homogène, mais un ensemble de différentes sous-populations différenciées au cours du développement et dont les futurs destins neuronaux spécialisés semblent prédéterminés ; ainsi chez le souriceau des expériences de microdissection suivies de greffe dans une autre région du cerveau montrent que les CS gardent le potentiel de différenciation neurale de leur région d’origine et n’acquièrent pas celui de la région dans laquelle elles ont été greffées ; la base moléculaire de cette spécialisation est encore inconnue. Cette notion d’hétérogénéité fait penser que la thérapie cellulaire des affections neurodégénératives par des CS adultes risque de se heurter à des difficultés difficilement maîtrisables.
Une autre approche est l’utilisation de CS embryonnaires dont l’exemple le mieux documenté est celui de la maladie de Huntington. Rappelons qu’il s’agit d’une maladie héréditaire à transmission autosomique dominante, due à une amplification anormale du triplet CAG (glutamine) dans un exon du gène HD, l’accumulation de la protéine anormale entrainant une atteinte préférentielle des neurones GABAergiques du striatum, structure cérébrale impliquée dans la régulation des fonctions motrices, cognitives et comportementales ; l’affection se déclare habituellement entre 30 et 50 ans et conduit inéluctablement à la mort des patients en 10 à 20 ans. Une thérapie cellulaire reposant sur la transplantation intracérébrale de neuroblastes fœtaux issus du télencéphale ventral (région à l’origine du striatum) s’est soldée par des améliorations cliniques notables pendant une période de 4 à 6 ans, l’échappement observé étant vraisemblablement dû à une quantité insuffisante de cellules injectées. Les difficultés juridiques, éthiques et matérielles rendent difficile la résolution de ce problème quantitatif et suscitent le recours aux CS embryonnaires (ou plus récemment aux iPS). Différents protocoles de différenciation de lignages neuraux ont été mis au point ; dans le cas des neurones striataux ce protocole reproduit en 70 jours les trois étapes successives de l’ontogenèse :
1) induction neurale conduisant en une vingtaine de jours à la production de cellules neuroépithéliales organisées en structures circulaires (ou rosettes neurales) exprimant les filaments de nestine et les facteurs de transcription PAX6, SOX1 et BF1 (spécifiques du télencéphale) ;
2) expansion et orientation de ces précurseurs neuronaux vers le phénotype striatal grâce à deux cytokines : SHH (Sonic Hedge Hog) et DKK1 (Dickkopf1, inhibiteur de la voie de signalisation Wnt) ;
3) différenciation terminale de ces progéniteurs en neurones striataux en présence de BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), d’AMPc et d’acide valproïque. Plus de la moitié des neurones matures obtenus expriment la protéine DARPP-32 (Dopamine and cAMP-Regulated Phosphoprotein) spécifique des neurones du striatum, et plus d’un tiers synthétisent du GABA. Chez le rat dont le striatum a été détruit par injection locale d’acide quinolinique, les résultats des xénogreffes par des progéniteurs striataux dérivés de CS humaines sont concluants, néanmoins la maitrise des cellules transplantées reste insuffisante et demande d’être parfaitement contrôlée avant de passer aux essais cliniques.
La fréquence des accidents matériels entraînant des lésions traumatiques de la moelle épinière explique l’intérêt porté aux recherches visant à rétablir la continuité des circuits neuronaux. Chez le rat ces travaux utilisent, outre différents procédés de prévention de la cicatrice gliale et de stimulation de la régénération axonale, des greffes de neurones embryonnaires, de cellules non neuronales et surtout de CS intrinsèques ou non. Chez l’homme des CS sont présentes dans la zone péri-épendymaire ; en culture elles forment des neurosphères et sont capables de se différencier en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces CS pourraient a priori être ciblées pour donner naissance à des neurones monoaminergiques susceptibles de s’intégrer dans les circuits médullaires sous-lésionnels. Alternativement, des CS obtenues à partir d’une micro-biopsie pourraient également être transformées ex-vivo avant d’être greffées dans la moelle. Expérimentalement chez le rat la greffe de CS fœtales transfectées par la neurogénine 2 (facteur de différenciation et de croissance des neurones) a pour effet un certain degré de récupération fonctionnelle motrice ; ces cellules ne sont plus retrouvées 28 jours après cette greffe, ce qui est en faveur d’une régénération de circuits endogènes ; en outre, la réexpression de la sérotonine et de son récepteur suggère la formation de synapses fonctionnelles.
E. CARDIOLOGIE
Une thérapie cellulaire ou régénératrice cardiaque se justifie a priori dans deux grands types de maladies: l’infarctus du myocarde et l’insuffisance cardiaque. Un tel traitement de l’infarctus est soumis à une contrainte importante : la disponibilité quasi-immédiate en cellules. Les essais d’injections intra-coronariennes de culots de cellules préparés à partir d’un prélèvement de moelle osseuse, donc d’un milieu où les cellules souches pluripotentes sont très minoritaires n’ont conduit qu’à une amélioration de l’ordre de 3% de la fraction d’éjection du ventricule gauche. De la même façon, l’injection intraveineuse de CS mésenchymateuses ne donne aucun résultat significatif, la totalité de ces cellules étant captée par la rate ou les poumons. L’injection intra-coronarienne de telles CS mésenchymateuses autologues (préparées à partir de tissu adipeux) n’a donné également que des résultats décevants ; elle expose en outre au risque de thrombose des petits capillaires en raison de la taille importante de ces CS.
Dans le cas de l’insuffisance cardiaque, la thérapie cellulaire proprement dite s’avère inefficace et il est indispensable d’envisager une thérapie régénératrice. Les essais de différenciation de CS musculaires ou hématopoïétiques en cardiomyocytes ont été un échec. Il est donc nécessaire de faire appel aux CS embryonnaires : leur transformation en progéniteurs cardiaques se fait sous l’action du morphogène BMP 2 (« Bone Morphogenetic Protein ») et d’un inhibiteur du récepteur du FGF 2 (« Fibroblast Growth Factor 2 ») ; elle est marquée au quatrième jour par l’expression membranaire du marqueur SSEA 1 (« Stage Specific Embryonic Antigen ») (ou CD15 ou Lewis X). La différenciation n’étant efficace que pour environ 40 à 60% des cellules induites, il est ensuite nécessaire de faire un tri par cytométrie de flux, en particulier pour éviter la formation de tératomes. Ces progéniteurs cardiaques SSEA1 expriment les transcrits du tube cardiaque primaire et du mésoderme précoce, sont multipotents et susceptibles de donner naissance à plusieurs dérivés cellulaires en fonction des combinaisons de cytokines utilisées : cardiomyocytes exprimant actinine et connexine 43 ainsi que des signaux de potentiel d’action, cellules endothéliales et cellules musculaires lisses. L’emploi des CS embryonnaires se heurtant à des problèmes immunologiques, une autre possibilité serait bien entendu l’utilisation des iPS. Des essais thérapeutiques utilisant ces progéniteurs ont été menés chez des primates : ils ont obtenus une recolonisation du myocarde de l’ordre de 20%. Un essai clinique portant sur un petit nombre de patients souffrant d’insuffisance cardiaque est en préparation.
F. CANCEROLOGIE
Depuis quelques années deux modèles d’oncogenèse s’opposent : dans le modèle stochastique chaque cellule peut, à la suite d’une accumulation de différentes mutations en particulier dans les oncogènes, proliférer de façon indéfinie et former un clone tumoral indépendant ; un second modèle repose au contraire sur la notion de cellules souches cancéreuses (CSC) provenant de la transformation maligne de CS normales (ou de cellules apparentées tels les progéniteurs ou « Tumor Initiating Cells » ou TIC) ; seules ces CSC, qui représentent une fraction très minoritaire de la masse tumorale (moins de1%) auraient une capacité illimitée d’auto-renouvellement, contrairement aux cellules cancéreuses différenciées « banales » et à courte durée de vie. Aux propriétés caractéristiques des CS normales adultes, ces CS cancéreuses ajoutent des propriétés supplémentaires dues aux altérations génétiques : prolifération continue, autonomie métabolique par rapport aux « niches » environnementales dans lesquelles elles se sont développées, augmentation d’activité de leurs transporteurs membranaires (MDR….), de leurs capacités de migration, de survie en l’absence d’adhérence, de résistance à l’hypoxie…autant de propriétés favorisant la prolifération de la tumeur et la formation de métastases. Les conséquences thérapeutiques de l’existence de ces CSC sont potentiellement très importantes car leur résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie expliquerait certains échecs et certaines rechutes.
Les premiers arguments en faveur de l’existence des CSC sont venus de l’étude de certaines leucémies myéloïdes : le tri des cellules sur la base des marqueurs membranaires (CD) a démontré que seule une toute petite sous-population ( moins de 0,0001%) cellulaire de phénotype CD34+/CD38-, également caractéristique des CS hématopoïétiques normales, était capable de générer des populations post-mitotiques cancéreuses après injection à des souris immuno-déficientes NOD-SCID, alors que le reste des cellules leucémiques en était incapable. Des arguments semblables et convaincants ont également été obtenus pour diverses tumeurs solides : glioblastomes et CSC CD133+, tumeurs mammaires et CSC CD44+/CD24-, myélome et CSC CD138-. Un argument fonctionnel en faveur de l’existence de ces CSC est celui du cancer colique : en raison de la rapidité de renouvellement de la muqueuse intestinale (5 à 6 jours) il apparaît peu probable que les différentes mutations aient le temps de s’accumuler dans des cellules déjà différenciées et d’y reproduire les différentes étapes de la transformation maligne ; la preuve que l’évènement initial de la tumeur colique concernait bien les CS des cryptes a été apportée en 2009 (CCSC CD133+/ Lgr5+). La démonstration que les CSC représentent un phénomène général applicable à l’ensemble des maladies malignes n’a pas encore été faite, mais l’apparition de ce nouveau concept revêt une énorme importance car il modifie la compréhension des mécanismes physiopathologiques en cause dans l’apparition de ces états et surtout les cibles thérapeutiques : l’élimination d’une masse tumorale ne peut être efficace et durable que si elle s’accompagne de la disparition des cellules souches cancéreuses. Il est donc indispensable que la recherche pharmacologique s’attache à trouver des médicaments actifs sur ces CSC.
CONCLUSIONS et RECOMMANDATIONS
L’Académie de médecine s’est prononcée à plusieurs reprises et, dès 2002, sur l’étude et l’utilisation des cellules souches humaines (7). Elle a recommandé la collecte de sang placentaire dans les maternités et son stockage dans des banques publiques afin de préserver son utilisation exclusive à des fins d’allogreffes (8 ) et plus récemment, elle a envisagé la possible utilisation des cellules souches présentes dans la paroi du cordon (9). Dans un communiqué commun avec l’Académie des sciences, elle a demandé que les recherches sur les cellules embryonnaires humaines soient autorisées (10) et, plus récemment, elle a adopté une série de remarques concernant les propositions de la mission parlementaire sur la révision des lois de bioéthique présentées par son rapporteur Jean Leonetti (11) et a recommandé, entre autres, un assouplissement des conditions d’étude des cellules embryonnaires humaines (1). Nous ne reviendrons pas sur ces aspects légaux et éthiques toujours sujets à débat, mais essaierons, pour conclure, de dresser une liste indicative des obstacles encore à surmonter pour l’utilisation des cellules souches dans le traitement des maladies humaines :
- la nécessité de mieux définir les microenvironnements assurant la différenciation vers un type de cellules donné,
- le faible rendement des préparations de cellules souches et de cellules différenciées en dérivant,
- le caractère souvent hétérogène de ces préparations rendant difficile les comparaisons des résultats obtenus,
- le risque d’effets tératogènes,
- le risque de réactions immunitaires sauf dans le cas des iPS, en supposant que la manipulation ex vivo de cellules n’entraîne pas leur modification avec l’expression de néoantigènes immunogènes, et, de façon moindre, dans le cas des cellules du sang de cordon et du cordon lui-même, le risque immunitaire étant plus faible à la naissance,
- les doutes sur l’efficacité au long cours des traitements.
Cette énumération montre que nous ne sommes qu’au début du chemin ; mais les résultats exposés laissent penser que les cellules souches humaines pourront être utilisées de façon efficace dans les maladies où il est nécessaire de remplacer des cellules absentes ou dysfonctionnelles. On doit se rappeler qu’il a fallu plus de 30 ans pour que les anticorps monoclonaux découverts en 1975 deviennent des médicaments efficaces disponibles sur le marché ; de même, la technique de production d’ADN recombinant introduite dans les années 70 a abouti à la disponibilité d’insuline humaine recombinante en 1982. On peut donc prévoir qu’il faudra quelques années encore pour aboutir à une utilisation effective des cellules souches en thérapeutique. Les investissements considérables effectués par l’industrie pharmaceutique dans ces nouvelles techniques soulignent tout l’intérêt qu’elle lui porte. On doit aussi rappeler que, dans l’état actuel des connaissances, les recherches sur les iPS ne peuvent pas totalement remplacer celles sur les cellules embryonnaires et qu’elles ne sont pas dénuées de tout problème éthique, par exemple au cas où on parviendrait à reprogrammer des cellules germinales.
Pour toutes ces raisons, l’Académie nationale de médecine tient à rappeler et préciser ses prises de position antérieures dans le domaine des cellules souches embryonnaires provenant d’embryons surnuméraires, non transférables ou soumis à DPI :
1- Supprimer le principe d’interdiction de la recherche sur l’embryon et donc ne pas maintenir le régime dérogatoire prévu dans la loi de bioéthique ; autoriser l’utilisation des cellules souches embryonnaires à des fins de recherche sous le contrôle de l’Agence de la biomédecine en remplaçant le terme «finalité thérapeutique» par «finalité médicale ou scientifique» et en supprimant la référence à l’absence d’alternative.
2- Supprimer les entraves à l’importation et à l’exportation des lignées en dérivant.
3- Elargir le domaine des recherches pour lesquelles les couples devraient pouvoir donner leur consentement en l’absence de projet parental : recherches pour lutter contre la stérilité et améliorer les méthodes d’assistance médicale à la procréation, recherches pour améliorer les connaissances sur le développement embryonnaire, recherches sur les cellules souches embryonnaires et leurs dérivés.
4- Créer un nombre restreint de centres de ressource biologique dédiés à la collecte des embryons surnuméraires, au stockage des embryons et des cellules embryonnaires, à la préparation des cellules embryonnaires et à leur distribution. Ces centres qui devraient être soumis à un strict contrôle seraient organisés sous forme de réseau de banques locales ou de structure centralisée telle le « UK stem cell bank »
5- Interdire la création d’embryons transgéniques ou chimériques.
6- Promouvoir les recherches sur les cellules souches mésenchymateuses du cordon et du placenta tant dans le domaine fondamental que préclinique.
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REFERENCES CITEES DANS LE TEXTE
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2- Takahashi K, Yamanaka S. Induction pf pluripotent stem celles from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006; 126: 663-676.
3- Espejel S, Roll GR, McLaughin KJ, Lee AY, Zhang JY, Laird DJ, Okita K, Yamanaka S, Willenbring H. Induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes have the functional and proliferative capabilities needed for liver regeneration in mice. J Clin Invest 2010;120: 3120-3126.
4- Rashid ST, Corbineau S, Hannan N, Marciniak SJ, Miranda E, Alexander G, Huang-Doran I, Griffin J, Ahrlund-Richter L, Skepper J, Semple R, Weber A, Lomas DA, Vallier L. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest 2010; 120: 3127-3136.
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7- David G. Communiqué concernant le projet de loi relatif à la bioéthique. Bull. Acad. Natle Med. 2002 ; 186 :195-203.
8- Bourel M, Ardaillou R. Les banques de sang de cordon autologue. Bull Natle Acad Med. 2002 ; 186 : 1543-1550.
9- Caen J. Les cellules souches du cordon et du placenta : de la recherche aux applications thérapeutiques. Bull. Acad. Natle Med. 2010 ; 194 : 141-152.
10- Pellerin D. Sur les cellules souches embryonnaires humaines en médecine « régénératrice ».
Bull. Acad. Natle Med. 2002 ; 186 : 913-914.
11- Claeys A, Leonetti J. Rapport d’information N° 2235 fait au nom de la mission parlementaire sur la révision des lois de bioéthique. En ligne dans www.assemblee-nationale.fr
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LISTE DES PERSONNALITES AUDITIONNEES.
1- Pr. Jean-Jacques Lataillade, Centre de transfusion sanguine des Armées, Hôpital Percy, Clamart,
2- Pr. Luc Douay, Service d’hématologie, Hôpital Armand-Trousseau, Paris,
3- Mme Simone Batman, UMR CNRS 8137, CERSES, Centre Universitaire des Saints Pères, Paris
4- Dr. Laure Coulombel, Directeur de recherche, INSERM, Médecine sciences, 2, rue d'Alesia, 75014 Paris,
5- Monsieur Arnaud de Guerra, Direction médicale et scientifique, Agence de la biomédecine,
6- Dr. Marc Peschanski, Directeur de recherche, INSERM U861 et I-STEM AFM, Evry,
7- Pr. Gérard Tachdjian, Service d’histologie, embryologie, cytogénétique, hôpital Antoine Béclère, Clamart et INSERM U935,
8- Dr. Annelise Bennaceur-Griscelli, Directeur de recherche, unité INSERM U935, Hôpital Paul Brousse-Villejuif,
9- Mme Claire Chazaud, INSERM U931- GRED- UFR de Médecine, Clermont-Ferrand,
10- Dr. Raphael Scharfmann, Directeur de recherche, INSERM U845- Faculté de médecine Necker, Paris,
11- Pr. Daniel Louvard, Directeur de recherches, UMR 144 CNRS, Institut Curie, Paris,
12- Pr. Philippe Menasche, Unité de chirurgie cardiaque, Hôpital Georges Pompidou, Paris,
13- Dr. Alain PRIVAT, Directeur de recherche, INSERM U583, Physiopathologie et Thérapie des déficits sensoriels et moteurs, Institut des Neurosciences de Montpellier, Hôpital St. ELOI, Montpellier,
14- Dr. Pierre-Marie LLEDO, Directeur de recherche, Laboratoire « Perception et mémoire », Institut Pasteur et CNRS, Paris.
08/12/2010
Il existe différents types de cellules souches (CS) caractérisées par leurs propriétés fonctionnelles : CS embryonnaires totipotentes ( jusqu’au stade 8 blastomères -72 heures après la fécondation) capables d’induire la totalité du développement embryonnaire et fœtal ; CS embryonnaires pluripotentes isolées du blastocyste (5 jours), capables de se différencier en donnant les trois feuillets (ectoderme, endoderme, mésoderme) caractéristiques de la gastrulation et conduisant in vitro à des lignées immortelles ; à partir du 46ième jour CS fœtales, puis adultes spécialisées, dites multipotentes assurant le développement, puis le renouvellement des tissus, mais avec une efficacité diminuant avec l’âge (un cas particulier est celui des CS mésenchymateuses dont les propriétés sont voisines de la pluripotence) ; enfin, CS pluripotentes induites (iPS pour « induced pluripotent stem cells ») résultant de l’acquisition d’un nouvel état suivi de reprogrammation in vitro d’une cellule adulte sous l’effet d’un apport exogène de différents facteurs de transcription. L’ensemble des conditions du maintien en culture sans instabilité génétique des CS pluripotentes ou de leur différenciation en phénotypes cellulaires précis demande encore à être amélioré. En France, l’étude ou l’utilisation des CS embryonnaires pluripotentes ne peut se faire que dans un cadre réglementaire dérogatoire aux lois de bioéthique de 2004 établi pour 5 ans et relevant de l’Agence de la biomédecine.
L’intérêt des CS en thérapeutique repose sur l’espoir d’une médecine régénératrice. Malgré différents succès expérimentaux très prometteurs, les applications médicales sont encore aujourd’hui limitées : traitement des brûlures graves (greffon obtenu par culture de CS épidermiques), production de globules rouges fonctionnels à partir de CS CD34+ isolées de la moelle osseuse. Des développements importants sont attendus pour le traitement du diabète, des affections neurologiques (en particulier la maladie de Huntington), de l’infarctus du myocarde, de l’insuffisance cardiaque. Enfin en cancérologie, le rôle déterminant de la transformation maligne de CS devrait conduire à la mise au point de nouvelles stratégies pharmacologiques. Ces résultats soulignent l’intérêt thérapeutique prospectif des CS et la nécessité d’investissements dans ce domaine. La législation doit également évoluer comme le recommande l’Académie.
L’Académie a abordé récemment le sujet des cellules souches dans le cadre des remarques qu’elle a formulées à propos des recommandations accompagnant le rapport de la mission parlementaire sur la prochaine révision des lois de bioéthique (1). Le document ci-dessous résultant du travail de la commission I (biologie) apporte un élément d’information supplémentaire sur un thème en pleine évolution scientifique et dont les applications médicales espérées restent encore largement prospectives. Les résultats obtenus à ce jour soulignent cependant l’immense intérêt de cette voie de recherche et incitent à renouveler notre demande d’assurer aux chercheurs travaillant en France la liberté nécessaire à leurs recherches, en particulier sur les cellules souches embryonnaires humaines.
I. DIFFERENTS TYPES DE CELLULES SOUCHES
Après la fécondation, l’œuf ou zygote se divise en 2, puis 4 et 8 cellules ou blastomères identiques (72 heures). Les blastomères se polarisent ensuite en augmentant leurs contacts avec les cellules voisines et en aplatissant leurs surfaces externes : c’est la phase de compaction qui donne à l’embryon une forme de petite mûre ou morula (phase 16-32 cellules, 96 heures après la fécondation). Au stade 16 cellules l’embryon est formé de deux types cellulaires polarisés: externe et interne; au stade 32 les cellules externes commencent à acquérir leur identité d’appartenance à la lignée trophoblastique. Une cavité se forme ensuite progressivement à l’intérieur de l’embryon qui, au stade de blastocyste, (120 heures ou 5 jours), est ainsi formé d’une couche externe trophoblastique entourant la cavité et d’une masse cellulaire interne (MCI) ; celle-ci donnera naissance à deux feuillets distincts : une masse de cellules formant l’épiblaste (Epi) recouverte par un épithélium d’endoderme primitif (Epr). Au moment de l’implantation utérine (entre 6 et 12 jours chez l’Homme, 4,5 jours chez la Souris) l’embryon est formé de trois tissus: le tissu trophoblastique (Tr) qui participera ultérieurement à la formation du placenta, l’Epr qui donnera naissance en partie au sac vitellin, et l’Epi qui contribuera aux annexes embryonnaires et sera à l’origine de toutes les cellules de l’embryon lui-même, y compris ses cellules germinales.
Tout au long du développement embryonnaire puis fœtal, et enfin chez l’adulte, une série de cellules souches (CS) aux potentialités différentes peuvent être isolées et caractérisées :
. CS totipotentes jusqu’au stade 8 blastomères, capables d’induire la totalité du développement embryonnaire et fœtal
. CS pluripotentes isolées de la morula au stade 16-32 cellules.
. CS pluripotentes isolées du blastocyste.
Aux trois tissus embryonnaires présents lors de l’implantation (Tr, Epi et Epr) correspondent trois modèles in vitro de cellules souches dont le plus étudié est celui des cellules épiblastiques précoces et tardives, ces dernières capables de se différencier en donnant les trois feuillets embryonnaires (ectoderme, endoderme et mésoderme) caractéristiques de la gastrulation.
Après le 46ème jour de développement chez le fœtus, puis chez l’adulte, les différents tissus contiennent des CS spécialisées dites multipotentes assurant le développement, puis le renouvellement des tissus, mais avec une efficacité diminuant avec l’âge. Les propriétés des CS fœtales et adultes ne sont pas fondamentalement différentes. Chez le fœtus certaines d’entre elles, largement minoritaires, sont circulantes et peuvent être isolées du sang de cordon. Enfin, un cas particulier est celui des cellules souches mésenchymateuses isolées de la moelle osseuse, du tissu adipeux, du sang de cordon ou du cordon lui-même et dont les propriétés semblent voisines de la pluripotence. Le cas des cellules germinales de l’adulte est particulier. Unipotentes, elles ne deviennent totipotentes que par la fécondation.
. Pour compléter cette liste il est maintenant nécessaire d’y rajouter les cellules souches pluripotentes induites (iPS ou « Induced Pluripotent Stem cells ») résultant de l’acquisition d’un nouvel état suivie de la reprogrammation in vitro d’une cellule adulte après transfert dans cette cellule de différents facteurs de transcription.
En l’absence de marqueurs moléculaires spécifiques actuellement caractérisés, la définition d’une CS est essentiellement fonctionnelle et repose sur sa capacité à donner naissance à l’embryon ou au tissu d’intérêt. Dans le cas des CS embryonnaires, deux propriétés majeures sont retenues : l’autorenouvellement et la pluripotence. Ces deux propriétés impliquent que la division cellulaire soit à l’origine ou d’une cellule semblable à la cellule mère (autorenouvellement) ou d’un progéniteur qui va se différencier en cellules spécialisées selon le milieu (pluripotence).
L’immortalité par auto-renouvellement illimité des CS embryonnaires (et des iPS ) offre la possibilité théorique de sources inépuisables de cellules animales ou humaines ; cependant les conditions biologiques et techniques de leur entretien et de leur différenciation ne sont pas encore entièrement maitrisées : les lignées dérivées d’embryons normaux présentent une instabilité génétique au cours des repiquages successifs, avec apparition de diverses anomalies chromosomiques (en particulier une duplication en 20q 11-21), ce qui impose une vérification régulière de leur statut génétique ; la culture de CS embryonnaires nécessite la présence d’un substratum de cellules nourricières (fibroblastes…) et de différentes cytokines dont le bFGF (« basic Fibroblast Growth Factor ») pour maintenir leurs capacités d’auto-renouvellement et de pluripotence. Les produits d’origine animale utilisés habituellement dans ces cultures (fibroblastes embryonnaires de souris, sérum de veau fœtal …..) dont les risques potentiels (réactions immunologiques, transmission d’agents pathogènes…) sont un frein aux applications cliniques, tendent aujourd’hui à être remplacés par des produits humains.
Pour résoudre des problèmes quantitatifs de production, de nouveaux procédés de culture en suspension (et non plus sur milieux solides) sont à l’étude….La culture de CS embryonnaires demande donc l’établissement et le respect de protocoles entièrement et rigoureusement standardisés. Enfin la mise en pratique médicale d’applications thérapeutiques nécessite que ces protocoles puissent passer des laboratoires de recherche à l’industrie pharmaceutique en vue d’une production standardisée et abondante, ce qui demande des mises au point et des investissements spécifiques.
La pluripotence des CS se définit chez la souris par leur capacité, lorsqu’elles sont injectées dans un blastocyste, à développer un embryon chimérique. Si préalablement à l’injection de CS embryonnaires, une électrofusion provoque la transformation d’un blastomère à deux cellules en blastomère tétraploïde conduisant ainsi à la formation des annexes extra-embryonnaires, l’embryon obtenu dérive entièrement des CS (la même démonstration a été faite avec les iPS). Pour des raisons techniques et surtout éthiques les mêmes démonstrations sont impossibles avec des lignées de CS embryonnaires humaines et le critère de pluripotence retenu est leur capacité d’induire la formation de tératomes (formés de façon anarchique par les dérivés des trois tissus embryonnaires) lorsqu’elles sont injectées à des souris immunodéficientes. Au plan biologique, la pluripotence est donc la capacité des CS embryonnaires (et des iPS) à se différencier en n’importe quel phénotype cellulaire ; cet état de pluripotence dépend de l’expression de différents facteurs de transcription (OCT4, SOX2, NANOG, SALL4….), d’une conformation de la chromatine, « ouverte » et non « fermée » comme chez l’adulte, et permettant ainsi l’expression des gènes de la pluripotence, de facteurs épigénétiques (modifications biochimiques telles que l’acétylation ou la méthylation des histones, la méthylation des ADN….), mais l’ensemble de ces conditions biologiques est encore loin d’avoir été identifié. La suppression du bFGF du milieu de culture induit un programme de différenciation dont la finalité dépend de la nature des cytokines et facteurs de croissance apportés, et dont le bon déroulement nécessite le respect parfait de toutes les étapes du développement ontologique normal, ce qui explique sans doute les difficultés expérimentales à obtenir des cellules totalement différenciées en type adulte. En outre, si les protocoles utilisés aujourd’hui permettent d’obtenir une vingtaine de phénotypes cellulaires précis, il ne s’agit dans la plupart des cas que d’un enrichissement et non de l’obtention d’une population homogène, ce qui demande une phase supplémentaire de tri cellulaire qui reste de faible rendement. L’ensemble des facteurs nécessaires pour guider la différenciation d’une CS pluripotente vers un phénotype particulier parmi des centaines de possibilités est encore loin d’être connu ; leur identification et la mise au point de protocoles rigoureusement standardisés sont donc à ce jour nécessaires.
Rappelons que si en 2009 il y avait dans le monde environ 500 lignées de CS embryonnaires normales et une vingtaine porteuses d’une anomalie génétique, dont 4 avec des anomalies chromosomiques, dans notre pays les demandes d’importation ou de création de ces lignées ne peuvent se faire que dans un cadre réglementaire dérogatoire aux lois de bioéthique de 2004 établi pour 5 ans. Ce système d’abord géré par les ministères relève maintenant de la compétence de l’Agence de la biomédecine qui délivre les autorisations nécessaires pour effectuer des recherches sur embryons ou cellules souches embryonnaires humaines, les conserver, les importer ou les exporter, et cela au vu de programmes répondant à un certain nombre de conditions et de critères, en particulier la perspective de progrès thérapeutiques notables et l’absence de méthodes alternatives. L’Agence contrôle la mise en œuvre de ces programmes et assure leur suivi. A ce jour, elle a délivré 50 autorisations contre 8 refus ; six projets ont été autorisés à dériver de nouvelles lignées, 25 de ces lignées ont été déclarées à l’Agence, dont une seule normale (à comparer avec le fait que plus de 150 000 embryons surnuméraires provenant de fécondations in vitro sont actuellement conservés dont 10 000 ayant fait l’objet d’un don pour la recherche), les autres étant issus d’un diagnostic préimplantatoire (DPI) et constituant des modèles pour l’étude d’anomalies génétiques ou chromosomiques. Les embryons sont développés jusqu’au stade de blastocyste : après élimination de la zone pellucide (par la pronase ou par laser) la masse cellulaire interne est isolée et mise en culture. La grande majorité des projets en cours utilise donc des lignées de CS embryonnaires importées de l’étranger avec différentes finalités : biologie de l’embryon (études des mécanismes de ségrégation chromosomique, d’apoptose, d’inactivation du chromosome X, de méthylation de l’ADN…), thérapie cellulaire, stratégie de criblage de molécules, modèles d’étude de maladies. Les pathologies étudiées affectent des tissus dérivés des trois feuillets embryonnaires : ectoderme (maladie de Huntington, maladie d’Alhzeimer, ataxie spinocérébelleuse, génodermatoses…), mésoderme (hémopathies malignes, SIDA, myopathies…) et endoderme (mucoviscidose, maladies hépatiques…).
Les CS embryonnaires sont les seules pluripotentes, les CS fœtales ont un potentiel restreint de différenciation, néanmoins supérieur à celui des CS adultes ; celles-ci sont spécialisées par tissu, ne peuvent donner naissance à des lignées immortelles et sont sujettes au processus de sénescence (dont elles sont peut-être des acteurs déterminants). Dans un tissu, elles sont habituellement rares ; elles sont fragiles, d’un faible pouvoir d’amplification et localisées au fond d’une niche constituée de cellules stromales sécrétant différents facteurs qui les maintiennent dans un état indifférencié et d’une matrice extracellulaire. Ces CS adultes sont classées en trois groupes :
1) CS spécialisées appartenant à des tissus à taux de renouvellement élevé (épiderme, muqueuse intestinale, tissu hématopoiëtique…) et relativement faciles à identifier ;
2) CS spécialisées présentes dans des tissus à faible potentiel de renouvellement (poumon, rein, tissu nerveux…) et dont le comportement in vitro est souvent aberrant ( exemple des CS neurales formant des « neurosphères ») ;
3) CS généralistes désignées sous le terme de cellules souches mésenchymateuses , présentes principalement dans le sang du cordon, le cordon lui-même, le placenta et la moelle osseuse, et dont les capacités de différenciation sont étendues (tissus mésodermiques, mais aussi potentiellement, ectodermiques et endodermiques) (cf BANM 2010 194 141-152).
Une autre voie est également étudiée, celle de la création non physiologique de CS pluripotentes. Un premier exemple est celui du transfert dans un ovocyte énucléé du noyau d’une cellule somatique (ex : fibroblaste) qui se reprogramme et se réorganise comme le noyau d’une cellule embryonnaire, cette nouvelle CS conduisant ensuite au développement d’un embryon si le blastocyste ainsi créé est réintroduit dans un utérus gravide. Le premier exemple a été celui de la brebis Dolly. Sinon, on peut aussi dériver des cellules souches embryonnaires à partir de la masse interne, et dans ce cas, il ne s’agit plus d’un clonage reproductif. Une deuxième possibilité est la reprogrammation de noyaux somatiques en noyaux pluripotents par fusion avec une CS pluripotente (ex : lymphocyte B humain et CS embryonnaire murine conduisant à une cellule tétraploïde. Mais l’avancée majeure a été apportée en 2006 par les travaux de Takahashi et Yamanaka (2) qui ont démontré la possibilité de réaliser directement la reprogrammation de cellules somatiques en CS pluripotentes, à savoir les cellules souches pluripotentes induites (« induced pluripotent stem cells » ou iPS). A partir de fibroblastes de souris et, plus récemment, de fibroblastes humains, les iPS ont été obtenues en une trentaine de jours sous l’effet d’un apport exogène de facteurs de transcription (au minimum 4 dont obligatoirement OCT4 et SOX2) recombinés dans un vecteur rétroviral ou lentiviral. Cet apport exogène n’est en fait nécessaire que pendant une dizaine de jours, une surexpression endogène de ces facteurs étant ensuite suffisante pour assurer le relais. En raison des risques de transformation maligne, l’utilisation des vecteurs rétroviraux tend à être remplacée par celle d’adénovirus qui s’éliminent spontanément en une dizaine de jours ou encore mieux par l’apport direct des protéines recombinantes synthétisées in vitro. Au cours de cette reprogrammation, on observe une extinction progressive des gènes caractéristiques du fibroblaste, une réexpression de gènes embryonnaires (en particulier SSEA1 et 4), une activation de la télomérase, et, éventuellement, la réactivation d’un chromosome X sexuel. Pour des raisons encore mal comprises l’efficacité de cette technique est très faible : en moyenne 10 iPS humaines à partir de 50 000 fibroblastes du derme ; elle est améliorée par des agents de déméthylation comme l’acide valproïque, elle est meilleure à partir d’un fibroblaste fœtal qu’à partir d’un fibroblaste adulte. Les critères de pluripotence des iPS sont a priori les mêmes que ceux des CS : auto-renouvellement illimité en présence de bFGF, formation de corps embryoïdes in vitro et de tératomes après injection chez la souris, obtention de souris chimériques après injection dans un blastocyste ; néanmoins, les capacités de différenciation en un tissu donné ne sont ni constantes ni identiques d’une lignée à l’autre, et cela pour des raisons encore inconnues. Les iPS exposent également à un risque important de transformation maligne due à la présence de l’oncogène c-myc utilisé pour la reprogrammation (développement d’un carcinome dans 30 % des cas). L’intérêt porté à ce type de lignée cellulaire est dû au fait qu’elle présente potentiellement plusieurs avantages importants : origine non embryonnaire, possibilité d’établir une lignée spécifique d’un sujet ou d’un patient et donc absence de réaction immunitaire en cas d’utilisation thérapeutique. On a également parlé de l’absence de problèmes éthiques, religieux ou légaux, ce qui est inexact à différents égards. En effet, il y a nécessité de l’information et du consentement des personnes qui donnent leurs cellules pour obtenir des iPS, sachant que ces cellules peuvent ensuite être soumises à un séquençage génétique à large échelle, rendant caduque l’anonymisation des données. En outre, via la fusion avec un embryon tétraploïde, un clonage reproductif est théoriquement possible. Enfin, le problème de la reprogrammation en cellules germinales risque de se poser. Les iPS sont aujourd’hui un remarquable outil d’étude des mécanismes de la différenciation cellulaire, de modélisation de tout type de maladies génétiques, de criblage de molécules pharmacologiques….Néanmoins les anomalies observées (instabilité génétique, risque de transformation maligne, variabilité de différenciation…) demandent à être maitrisées avant de progresser vers leur utilisation en thérapie. Trois publications récentes apportent des résultats prometteurs. L’une, signée par le père de la technique S Yamanaka (3) montre qu’il est possible, chez la Souris, de reprogrammer des iPS en cellules hépatiques fonctionnelles capables de régénérer un foie amputé aux deux tiers ou un foie gravement atteint par déficit génétique en fumarylacétoacétate hydrolase. Les deux autres font conclure qu’il est possible d’obtenir des modèles cellulaires de maladies génétiques facilitant leur étude in vitro. D’une part, des cellules du foie ont été dérivées de cellules cutanées de patients atteints de maladies génétiques à expression hépatique en conservant les mêmes caractéristiques que les cellules du foie du donneur (4) ; d’autre part, des fibroblastes cutanées de patients atteints de la maladie du QT long ont été reprogrammées en cardiomyocytes porteurs de la mutation (5). On obtient ainsi dans les deux cas de précieux modèles d’étude.
II. INTERET PROSPECTIF EN THERAPEUTIQUE
Bien que les cellules souches suscitent de nombreux intérêts en biologie fondamentale ou en pharmacologie, notre propos se limitera aux perspectives thérapeutiques. Elles découlent de l’espoir d’une médecine régénératrice et concernent la plupart des spécialités médicales. Nous donnons ci-dessous quelques résultats à titre d’exemples.
A. DERMATOLOGIE
Rappelons que chez les mammifères, le renouvellement après desquamation des cellules de la surface externe de la peau est assuré par les kératinocytes de la couche basale qui se divisent activement et se différencient en cellules de la couche cornée. Cette activité implique l’existence de cellules souches : l’épiderme interfolliculaire et les follicules pileux possèdent leurs propres CS spécialisées. Contrairement aux CS des follicules pileux confinés dans une niche appelée « bulge », les CS de l’épiderme sont disséminées le long de la membrane basale.
Le traitement des brûlures étendues implique d’une part l’excision des tissus nécrosés et lorsque les surfaces atteintes sont très étendues leur protection temporaire par des peaux allogéniques conservées au congélateur, et d’autre part, secondairement, une greffe autologue d’épiderme. Le greffon est préparé en 3 à 4 semaines par culture in vitro de CS épidermiques (ou progéniteurs de kératinocytes) isolées d’un fragment de peau intacte. Ce traitement sauve la vie de grands brûlés, mais au prix de lourdes séquelles (cicatrices, brides…) dues pour l’essentiel à l’absence de régénération du derme et/ou aux mauvaises qualités des jonctions dermo-épidermiques. Une amélioration de la qualité du greffon est obtenue par culture des kératinocytes sur une matrice de fibrine incluant des CS mésenchymateuses dont sont mises à profit les propriétés stimulatrices de la prolifération de ces cellules, ainsi que les propriétés immuno-modulatrices, antiseptiques, anti-inflammatoires et paracrines. Dans ces conditions sont obtenus des feuillets formés de trois ou quatre assises de kératinocytes entièrement cohésives et jointives contrairement au procédé classique, et reposant sur une couche de cellules épithéliales.
Les lésions provoquées par les sources radioactives sont non seulement superficielles mais aussi profondes, très douloureuses, inflammatoires et extensives, nécessitant des amputations tissulaires importantes et souvent répétées. Chez ces patients (rares), l’effet bénéfique des cellules mésenchymateuses autologues (obtenues par ponction de moelle osseuse puis culture dans un milieu enrichi en facteurs de croissance apportés par un lysat de plaquettes sanguines) semble démontré.
Des perspectives intéressantes sont apportées par des travaux expérimentaux récents (6) montrant la capacité des cellules souches de thymus de rat prélevées après la naissance à se transformer sans manipulation génétique en cellules de la peau lorsqu’elles sont cultivées dans le microenvironnement physiologique de ces cellules. Les cellules cutanées, ainsi obtenues, produisent chez le Rat après transplantation une peau normale avec ses différents éléments dont l’épiderme, les follicules pileux et les glandes sébacées, ce qui constitue un progrès important par rapport à la simple reconstitution de l’épiderme.
B. HEMATOLOGIE
La production in vitro de globules rouges (GR) est susceptible de présenter un grand intérêt pratique car, en raison du vieillissement de la population, les besoins de transfusion sanguine risquent de ne plus être couverts par les seuls dons. Depuis plus d’un demi-siècle, les recherches de produits de substitution remplissant les fonctions de transporteur d’oxygène se sont avérées infructueuses, à l’exception toutefois de l’utilisation du perfluorocarbone dans certaines circonstances opératoires. Depuis quelques années la synthèse de GR est possible in vitro à partir de cellules souches CD34+ isolées de la moelle osseuse, du sang circulant ou du sang de cordon ; le protocole comporte trois phases : 1) prolifération et induction de la différenciation érythroïde en présence de facteurs de croissance, d’interleukine 3 et d’érythropoïetine , 2) culture sur un modèle reconstituant le microenvironnement physiologique avec en particulier des cellules mésenchymateuses et en présence d’érythropoïetine seule, 3) culture en présence des seules cellules stromales et en l’absence de tout facteur de croissance. Au cours de ce protocole de 18 à 20 jours les cellules parcourent les différents stades de la différenciation : proérythroblaste, érythroblaste basophile, acidophile, réticulocyte et globule rouge énucléé (environ 95%). Cette différenciation n’est cependant pas totale au plan métabolique car la majorité du contenu globulaire est constitué d’hémoglobines adultes et fœtales ; ces hémoglobines sont parfaitement fonctionnelles et le contenu enzymatique (glucose 6 phosphate déshydrogénase, pyruvate kinase….) est normal témoignant de sa capacité à maintenir un taux d’ATP suffisant pour éviter l’accumulation du 2-3 diphosphoglycérate qui entraînerait elle-même une diminution d’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène. La production expérimentale en laboratoire de ces GR est bien entendu quantitativement limitée et le développement industriel de ce protocole nécessiterait la mise au point de bioréacteurs adaptés.
La solution idéale pour satisfaire tous les besoins de la transfusion sanguine serait de disposer d’une source permanente et illimitée de produits sanguins. Une première possibilité est l’utilisation de CS embryonnaires dont la différenciation se fait en deux grandes étapes : d’abord en cellules souches CD34+, puis en cellules érythroïdes ; les protocoles actuels n’obtiennent qu’une différenciation incomplète puisque 30 à 60% des globules sont encore nucléés et contiennent des hémoglobines embryonnaires et fœtales. Une deuxième possibilité est d’utiliser les CS pluripotentes induites ou iPS : le protocole de différenciation est semblable au précédent mais la proportion de cellules énucléées est encore plus faible (environ 10%). Trois lignées d’iPS et deux lignées de CS embryonnaires sont actuellement utilisées expérimentalement ; au-delà des difficultés à maitriser une différenciation complète, un problème majeur à résoudre est celui de l’insuffisance des rendements : une CS conduisant à environ 500 GR et une iPS à environ 350.
Outre la satisfaction quantitative des besoins transfusionnels ou qualitative, par exemple chez des patients allo-immunisés ou présentant des groupes rares, différentes applications thérapeutiques peuvent également être espérées des iPS comme le traitement de la drépanocytose par substitution de l’Hb A ou F normales à l’Hb S tel que cela vient d’être expérimentalement réalisé chez des souris humanisées drépanocytaires. A côté de la production de globules rouges, on peut penser pouvoir aussi obtenir des cellules hématopoïétiques pour les greffes autologues dans le traitement des différentes hémopathies malignes comme les aplasies médullaires ou les leucémies aiguës.
C. PANCREAS et DIABETE :
Le diabète étant défini simplement sur le plan physiopathologique comme une incapacité de la masse des cellules β à réguler la glycémie (destruction de ces cellules dans le cas du type I, insuffisance fonctionnelle dans le type II), la greffe cellulaire apparait logiquement comme une alternative aux traitements médicamenteux et dès 2000 les premières tentatives de thérapie cellulaire par greffe d’îlots de Langerhans ont été publiées. Les sources alternatives de cellules β sont potentiellement de deux types : non physiologiques (xénogreffe ou transdifférenciation à partir d’autres tissus tels que le foie, la moelle osseuse, le tube digestif…) ou physiologiques (différenciation à partir de CS embryonnaires, d’iPS, de CS du pancréas fœtal ou adulte). La différenciation en cellules β synthétisant de l’insuline à partir de CS embryonnaires implique de reproduire in vitro l’ensemble des étapes de l’embryogenèse ; ce processus n’est pas encore complètement maitrisé, en particulier dans ses dernières phases : s’il est en effet possible d’obtenir de l’endoderme, puis des progéniteurs pancréatiques, il ne l’est pas encore pour les cellules β adultes. Etant donné l’énorme intérêt potentiel médical mais aussi financier de cette thérapie cellulaire, de nombreuses structures (laboratoires académiques, firmes de biotechnologie et laboratoires pharmaceutiques) s’intéressent à cette question. Une autre possibilité est de partir de CS pancréatiques (thérapie régénératrice) : l’existence de tels progéniteurs a été prouvée chez la souris ; il reste à faire la même démonstration chez l’homme, à caractériser les facteurs biologiques contrôlant la transformation de ces progéniteurs en cellules β et à trouver éventuellement des molécules susceptibles de déclencher le processus. De nombreux laboratoires investissent également dans le développement de cette thérapie régénératrice.
D. SYTEME NERVEUX
La notion classique d’un non renouvellement des cellules neurales adultes est aujourd’hui remise en cause, mais les applications thérapeutiques restent théoriques. Chez le rongeur adulte des CS sont présentes dans la zone sous-ventriculaire du cerveau et leur principale activité est d’assurer le renouvellement des cellules du bulbe olfactif : environ 30 000 cellules y sont produites chaque jour, soit à peu près 1% de l’effectif cellulaire total ; elles ont une durée de vie de quelques semaines et, en cas de stimulation olfactive, la synthèse peut atteindre 60 000 neurones par jour. Les cellules souches de la zone sous-ventriculaire sont des astrocytes exprimant entre autres la GFAP (« Glial Fibrillar Acidic Protein »). Il a été démontré que ces CS ne constituaient pas une population homogène, mais un ensemble de différentes sous-populations différenciées au cours du développement et dont les futurs destins neuronaux spécialisés semblent prédéterminés ; ainsi chez le souriceau des expériences de microdissection suivies de greffe dans une autre région du cerveau montrent que les CS gardent le potentiel de différenciation neurale de leur région d’origine et n’acquièrent pas celui de la région dans laquelle elles ont été greffées ; la base moléculaire de cette spécialisation est encore inconnue. Cette notion d’hétérogénéité fait penser que la thérapie cellulaire des affections neurodégénératives par des CS adultes risque de se heurter à des difficultés difficilement maîtrisables.
Une autre approche est l’utilisation de CS embryonnaires dont l’exemple le mieux documenté est celui de la maladie de Huntington. Rappelons qu’il s’agit d’une maladie héréditaire à transmission autosomique dominante, due à une amplification anormale du triplet CAG (glutamine) dans un exon du gène HD, l’accumulation de la protéine anormale entrainant une atteinte préférentielle des neurones GABAergiques du striatum, structure cérébrale impliquée dans la régulation des fonctions motrices, cognitives et comportementales ; l’affection se déclare habituellement entre 30 et 50 ans et conduit inéluctablement à la mort des patients en 10 à 20 ans. Une thérapie cellulaire reposant sur la transplantation intracérébrale de neuroblastes fœtaux issus du télencéphale ventral (région à l’origine du striatum) s’est soldée par des améliorations cliniques notables pendant une période de 4 à 6 ans, l’échappement observé étant vraisemblablement dû à une quantité insuffisante de cellules injectées. Les difficultés juridiques, éthiques et matérielles rendent difficile la résolution de ce problème quantitatif et suscitent le recours aux CS embryonnaires (ou plus récemment aux iPS). Différents protocoles de différenciation de lignages neuraux ont été mis au point ; dans le cas des neurones striataux ce protocole reproduit en 70 jours les trois étapes successives de l’ontogenèse :
1) induction neurale conduisant en une vingtaine de jours à la production de cellules neuroépithéliales organisées en structures circulaires (ou rosettes neurales) exprimant les filaments de nestine et les facteurs de transcription PAX6, SOX1 et BF1 (spécifiques du télencéphale) ;
2) expansion et orientation de ces précurseurs neuronaux vers le phénotype striatal grâce à deux cytokines : SHH (Sonic Hedge Hog) et DKK1 (Dickkopf1, inhibiteur de la voie de signalisation Wnt) ;
3) différenciation terminale de ces progéniteurs en neurones striataux en présence de BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), d’AMPc et d’acide valproïque. Plus de la moitié des neurones matures obtenus expriment la protéine DARPP-32 (Dopamine and cAMP-Regulated Phosphoprotein) spécifique des neurones du striatum, et plus d’un tiers synthétisent du GABA. Chez le rat dont le striatum a été détruit par injection locale d’acide quinolinique, les résultats des xénogreffes par des progéniteurs striataux dérivés de CS humaines sont concluants, néanmoins la maitrise des cellules transplantées reste insuffisante et demande d’être parfaitement contrôlée avant de passer aux essais cliniques.
La fréquence des accidents matériels entraînant des lésions traumatiques de la moelle épinière explique l’intérêt porté aux recherches visant à rétablir la continuité des circuits neuronaux. Chez le rat ces travaux utilisent, outre différents procédés de prévention de la cicatrice gliale et de stimulation de la régénération axonale, des greffes de neurones embryonnaires, de cellules non neuronales et surtout de CS intrinsèques ou non. Chez l’homme des CS sont présentes dans la zone péri-épendymaire ; en culture elles forment des neurosphères et sont capables de se différencier en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces CS pourraient a priori être ciblées pour donner naissance à des neurones monoaminergiques susceptibles de s’intégrer dans les circuits médullaires sous-lésionnels. Alternativement, des CS obtenues à partir d’une micro-biopsie pourraient également être transformées ex-vivo avant d’être greffées dans la moelle. Expérimentalement chez le rat la greffe de CS fœtales transfectées par la neurogénine 2 (facteur de différenciation et de croissance des neurones) a pour effet un certain degré de récupération fonctionnelle motrice ; ces cellules ne sont plus retrouvées 28 jours après cette greffe, ce qui est en faveur d’une régénération de circuits endogènes ; en outre, la réexpression de la sérotonine et de son récepteur suggère la formation de synapses fonctionnelles.
E. CARDIOLOGIE
Une thérapie cellulaire ou régénératrice cardiaque se justifie a priori dans deux grands types de maladies: l’infarctus du myocarde et l’insuffisance cardiaque. Un tel traitement de l’infarctus est soumis à une contrainte importante : la disponibilité quasi-immédiate en cellules. Les essais d’injections intra-coronariennes de culots de cellules préparés à partir d’un prélèvement de moelle osseuse, donc d’un milieu où les cellules souches pluripotentes sont très minoritaires n’ont conduit qu’à une amélioration de l’ordre de 3% de la fraction d’éjection du ventricule gauche. De la même façon, l’injection intraveineuse de CS mésenchymateuses ne donne aucun résultat significatif, la totalité de ces cellules étant captée par la rate ou les poumons. L’injection intra-coronarienne de telles CS mésenchymateuses autologues (préparées à partir de tissu adipeux) n’a donné également que des résultats décevants ; elle expose en outre au risque de thrombose des petits capillaires en raison de la taille importante de ces CS.
Dans le cas de l’insuffisance cardiaque, la thérapie cellulaire proprement dite s’avère inefficace et il est indispensable d’envisager une thérapie régénératrice. Les essais de différenciation de CS musculaires ou hématopoïétiques en cardiomyocytes ont été un échec. Il est donc nécessaire de faire appel aux CS embryonnaires : leur transformation en progéniteurs cardiaques se fait sous l’action du morphogène BMP 2 (« Bone Morphogenetic Protein ») et d’un inhibiteur du récepteur du FGF 2 (« Fibroblast Growth Factor 2 ») ; elle est marquée au quatrième jour par l’expression membranaire du marqueur SSEA 1 (« Stage Specific Embryonic Antigen ») (ou CD15 ou Lewis X). La différenciation n’étant efficace que pour environ 40 à 60% des cellules induites, il est ensuite nécessaire de faire un tri par cytométrie de flux, en particulier pour éviter la formation de tératomes. Ces progéniteurs cardiaques SSEA1 expriment les transcrits du tube cardiaque primaire et du mésoderme précoce, sont multipotents et susceptibles de donner naissance à plusieurs dérivés cellulaires en fonction des combinaisons de cytokines utilisées : cardiomyocytes exprimant actinine et connexine 43 ainsi que des signaux de potentiel d’action, cellules endothéliales et cellules musculaires lisses. L’emploi des CS embryonnaires se heurtant à des problèmes immunologiques, une autre possibilité serait bien entendu l’utilisation des iPS. Des essais thérapeutiques utilisant ces progéniteurs ont été menés chez des primates : ils ont obtenus une recolonisation du myocarde de l’ordre de 20%. Un essai clinique portant sur un petit nombre de patients souffrant d’insuffisance cardiaque est en préparation.
F. CANCEROLOGIE
Depuis quelques années deux modèles d’oncogenèse s’opposent : dans le modèle stochastique chaque cellule peut, à la suite d’une accumulation de différentes mutations en particulier dans les oncogènes, proliférer de façon indéfinie et former un clone tumoral indépendant ; un second modèle repose au contraire sur la notion de cellules souches cancéreuses (CSC) provenant de la transformation maligne de CS normales (ou de cellules apparentées tels les progéniteurs ou « Tumor Initiating Cells » ou TIC) ; seules ces CSC, qui représentent une fraction très minoritaire de la masse tumorale (moins de1%) auraient une capacité illimitée d’auto-renouvellement, contrairement aux cellules cancéreuses différenciées « banales » et à courte durée de vie. Aux propriétés caractéristiques des CS normales adultes, ces CS cancéreuses ajoutent des propriétés supplémentaires dues aux altérations génétiques : prolifération continue, autonomie métabolique par rapport aux « niches » environnementales dans lesquelles elles se sont développées, augmentation d’activité de leurs transporteurs membranaires (MDR….), de leurs capacités de migration, de survie en l’absence d’adhérence, de résistance à l’hypoxie…autant de propriétés favorisant la prolifération de la tumeur et la formation de métastases. Les conséquences thérapeutiques de l’existence de ces CSC sont potentiellement très importantes car leur résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie expliquerait certains échecs et certaines rechutes.
Les premiers arguments en faveur de l’existence des CSC sont venus de l’étude de certaines leucémies myéloïdes : le tri des cellules sur la base des marqueurs membranaires (CD) a démontré que seule une toute petite sous-population ( moins de 0,0001%) cellulaire de phénotype CD34+/CD38-, également caractéristique des CS hématopoïétiques normales, était capable de générer des populations post-mitotiques cancéreuses après injection à des souris immuno-déficientes NOD-SCID, alors que le reste des cellules leucémiques en était incapable. Des arguments semblables et convaincants ont également été obtenus pour diverses tumeurs solides : glioblastomes et CSC CD133+, tumeurs mammaires et CSC CD44+/CD24-, myélome et CSC CD138-. Un argument fonctionnel en faveur de l’existence de ces CSC est celui du cancer colique : en raison de la rapidité de renouvellement de la muqueuse intestinale (5 à 6 jours) il apparaît peu probable que les différentes mutations aient le temps de s’accumuler dans des cellules déjà différenciées et d’y reproduire les différentes étapes de la transformation maligne ; la preuve que l’évènement initial de la tumeur colique concernait bien les CS des cryptes a été apportée en 2009 (CCSC CD133+/ Lgr5+). La démonstration que les CSC représentent un phénomène général applicable à l’ensemble des maladies malignes n’a pas encore été faite, mais l’apparition de ce nouveau concept revêt une énorme importance car il modifie la compréhension des mécanismes physiopathologiques en cause dans l’apparition de ces états et surtout les cibles thérapeutiques : l’élimination d’une masse tumorale ne peut être efficace et durable que si elle s’accompagne de la disparition des cellules souches cancéreuses. Il est donc indispensable que la recherche pharmacologique s’attache à trouver des médicaments actifs sur ces CSC.
CONCLUSIONS et RECOMMANDATIONS
L’Académie de médecine s’est prononcée à plusieurs reprises et, dès 2002, sur l’étude et l’utilisation des cellules souches humaines (7). Elle a recommandé la collecte de sang placentaire dans les maternités et son stockage dans des banques publiques afin de préserver son utilisation exclusive à des fins d’allogreffes (8 ) et plus récemment, elle a envisagé la possible utilisation des cellules souches présentes dans la paroi du cordon (9). Dans un communiqué commun avec l’Académie des sciences, elle a demandé que les recherches sur les cellules embryonnaires humaines soient autorisées (10) et, plus récemment, elle a adopté une série de remarques concernant les propositions de la mission parlementaire sur la révision des lois de bioéthique présentées par son rapporteur Jean Leonetti (11) et a recommandé, entre autres, un assouplissement des conditions d’étude des cellules embryonnaires humaines (1). Nous ne reviendrons pas sur ces aspects légaux et éthiques toujours sujets à débat, mais essaierons, pour conclure, de dresser une liste indicative des obstacles encore à surmonter pour l’utilisation des cellules souches dans le traitement des maladies humaines :
- la nécessité de mieux définir les microenvironnements assurant la différenciation vers un type de cellules donné,
- le faible rendement des préparations de cellules souches et de cellules différenciées en dérivant,
- le caractère souvent hétérogène de ces préparations rendant difficile les comparaisons des résultats obtenus,
- le risque d’effets tératogènes,
- le risque de réactions immunitaires sauf dans le cas des iPS, en supposant que la manipulation ex vivo de cellules n’entraîne pas leur modification avec l’expression de néoantigènes immunogènes, et, de façon moindre, dans le cas des cellules du sang de cordon et du cordon lui-même, le risque immunitaire étant plus faible à la naissance,
- les doutes sur l’efficacité au long cours des traitements.
Cette énumération montre que nous ne sommes qu’au début du chemin ; mais les résultats exposés laissent penser que les cellules souches humaines pourront être utilisées de façon efficace dans les maladies où il est nécessaire de remplacer des cellules absentes ou dysfonctionnelles. On doit se rappeler qu’il a fallu plus de 30 ans pour que les anticorps monoclonaux découverts en 1975 deviennent des médicaments efficaces disponibles sur le marché ; de même, la technique de production d’ADN recombinant introduite dans les années 70 a abouti à la disponibilité d’insuline humaine recombinante en 1982. On peut donc prévoir qu’il faudra quelques années encore pour aboutir à une utilisation effective des cellules souches en thérapeutique. Les investissements considérables effectués par l’industrie pharmaceutique dans ces nouvelles techniques soulignent tout l’intérêt qu’elle lui porte. On doit aussi rappeler que, dans l’état actuel des connaissances, les recherches sur les iPS ne peuvent pas totalement remplacer celles sur les cellules embryonnaires et qu’elles ne sont pas dénuées de tout problème éthique, par exemple au cas où on parviendrait à reprogrammer des cellules germinales.
Pour toutes ces raisons, l’Académie nationale de médecine tient à rappeler et préciser ses prises de position antérieures dans le domaine des cellules souches embryonnaires provenant d’embryons surnuméraires, non transférables ou soumis à DPI :
1- Supprimer le principe d’interdiction de la recherche sur l’embryon et donc ne pas maintenir le régime dérogatoire prévu dans la loi de bioéthique ; autoriser l’utilisation des cellules souches embryonnaires à des fins de recherche sous le contrôle de l’Agence de la biomédecine en remplaçant le terme «finalité thérapeutique» par «finalité médicale ou scientifique» et en supprimant la référence à l’absence d’alternative.
2- Supprimer les entraves à l’importation et à l’exportation des lignées en dérivant.
3- Elargir le domaine des recherches pour lesquelles les couples devraient pouvoir donner leur consentement en l’absence de projet parental : recherches pour lutter contre la stérilité et améliorer les méthodes d’assistance médicale à la procréation, recherches pour améliorer les connaissances sur le développement embryonnaire, recherches sur les cellules souches embryonnaires et leurs dérivés.
4- Créer un nombre restreint de centres de ressource biologique dédiés à la collecte des embryons surnuméraires, au stockage des embryons et des cellules embryonnaires, à la préparation des cellules embryonnaires et à leur distribution. Ces centres qui devraient être soumis à un strict contrôle seraient organisés sous forme de réseau de banques locales ou de structure centralisée telle le « UK stem cell bank »
5- Interdire la création d’embryons transgéniques ou chimériques.
6- Promouvoir les recherches sur les cellules souches mésenchymateuses du cordon et du placenta tant dans le domaine fondamental que préclinique.
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REFERENCES CITEES DANS LE TEXTE
1- Chapuis Y, Jouannet P, Ardaillou R. Réflexions relatives au rapport d’information n° 2235 de la mission parlementaire sur la révision des lois de bioéthique. Rapport adopté le 25 juin 2010. En ligne dans www.academie-medecine.fr.
2- Takahashi K, Yamanaka S. Induction pf pluripotent stem celles from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006; 126: 663-676.
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4- Rashid ST, Corbineau S, Hannan N, Marciniak SJ, Miranda E, Alexander G, Huang-Doran I, Griffin J, Ahrlund-Richter L, Skepper J, Semple R, Weber A, Lomas DA, Vallier L. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest 2010; 120: 3127-3136.
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7- David G. Communiqué concernant le projet de loi relatif à la bioéthique. Bull. Acad. Natle Med. 2002 ; 186 :195-203.
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9- Caen J. Les cellules souches du cordon et du placenta : de la recherche aux applications thérapeutiques. Bull. Acad. Natle Med. 2010 ; 194 : 141-152.
10- Pellerin D. Sur les cellules souches embryonnaires humaines en médecine « régénératrice ».
Bull. Acad. Natle Med. 2002 ; 186 : 913-914.
11- Claeys A, Leonetti J. Rapport d’information N° 2235 fait au nom de la mission parlementaire sur la révision des lois de bioéthique. En ligne dans www.assemblee-nationale.fr
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LISTE DES PERSONNALITES AUDITIONNEES.
1- Pr. Jean-Jacques Lataillade, Centre de transfusion sanguine des Armées, Hôpital Percy, Clamart,
2- Pr. Luc Douay, Service d’hématologie, Hôpital Armand-Trousseau, Paris,
3- Mme Simone Batman, UMR CNRS 8137, CERSES, Centre Universitaire des Saints Pères, Paris
4- Dr. Laure Coulombel, Directeur de recherche, INSERM, Médecine sciences, 2, rue d'Alesia, 75014 Paris,
5- Monsieur Arnaud de Guerra, Direction médicale et scientifique, Agence de la biomédecine,
6- Dr. Marc Peschanski, Directeur de recherche, INSERM U861 et I-STEM AFM, Evry,
7- Pr. Gérard Tachdjian, Service d’histologie, embryologie, cytogénétique, hôpital Antoine Béclère, Clamart et INSERM U935,
8- Dr. Annelise Bennaceur-Griscelli, Directeur de recherche, unité INSERM U935, Hôpital Paul Brousse-Villejuif,
9- Mme Claire Chazaud, INSERM U931- GRED- UFR de Médecine, Clermont-Ferrand,
10- Dr. Raphael Scharfmann, Directeur de recherche, INSERM U845- Faculté de médecine Necker, Paris,
11- Pr. Daniel Louvard, Directeur de recherches, UMR 144 CNRS, Institut Curie, Paris,
12- Pr. Philippe Menasche, Unité de chirurgie cardiaque, Hôpital Georges Pompidou, Paris,
13- Dr. Alain PRIVAT, Directeur de recherche, INSERM U583, Physiopathologie et Thérapie des déficits sensoriels et moteurs, Institut des Neurosciences de Montpellier, Hôpital St. ELOI, Montpellier,
14- Dr. Pierre-Marie LLEDO, Directeur de recherche, Laboratoire « Perception et mémoire », Institut Pasteur et CNRS, Paris.
08/12/2010
